動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（DNase I）說明書
RNApure Tissue Kit（DNase I）
動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（DNase I）
目錄號(hào)：K0560
保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃
其它組分：室 溫
組分說明
Cat.No. K0560
KitSize 50
DNaseI 1000U
10×ReactionBuffer 1000 μl
BufferRL 35ml
BufferRW1 40ml
BufferRW2（concentrate） 11ml
RNase-FreeWater 10ml
SpinColumnRM 50
CollectionTube（1.5ml） 50
CollectionTube（2ml） 50
產(chǎn)品簡介
本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術(shù)與硅基質(zhì)膜純化技術(shù)相結(jié)合，可從動(dòng)物細(xì)胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般多 30mg 組織或 1x107 細(xì)胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉(zhuǎn)錄和酶促反應(yīng)后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質(zhì) RNA，幾乎無 DNA 殘留。如果要進(jìn)行對(duì)微量 DNA 非常敏感的 RNA 實(shí)驗(yàn)，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase 在柱上進(jìn)行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、NothernBlot、DotBlot等下游實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3）配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。
4）操作人員戴一次性*罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。
2. 提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。
3. BufferRL 在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇，1mlBufferRL 加 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 BufferRL 室溫可保存1 個(gè)月。
4. 第-次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 BufferRW2 中加入無水乙醇。
5. BufferRL 如果產(chǎn)生沉淀，可于 56℃加熱使其溶解后室溫放置。
6. 所有離心步驟均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動(dòng)作要迅速。
自備試劑： β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA）
操作步驟
1. 樣品處理
1a. 組織：將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600 μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20 mg加350 μl Buffer RL。樣品體積不超過BufferRL體積的十分之一。
1b 單層培養(yǎng)細(xì)胞：將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中直接裂解或處理成細(xì)胞懸液，離心得到細(xì)胞沉淀，棄上清，每6-10 cm 2培養(yǎng)面積加入600 μl Buffer RL，小于6 cm2 加入350 μl Buffer RL，反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。
1c. 細(xì)胞懸液：12,000rpm6（～13,400×g）離心1分鐘棄上清，得到細(xì)胞沉淀。每5×106 -1×107 細(xì)胞加入600 μl Buffer RL ，少于5×106細(xì)胞加入350 μl Buffer RL，反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。
注意：1）盡量除盡細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)基可能抑制細(xì)胞的裂解影響RNA產(chǎn)量。
2）盡量使細(xì)胞充分懸浮并充分裂解，否則影響RNA產(chǎn)量。
2. 樣品充分裂解后，室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物*分離。
3. 12000rpm離心2-5min，取上清進(jìn)行以下操作。
4. 向步驟3中得到的溶液中加入1倍體積（600 μl 或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。
注意：加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
5. 將上步所得溶液全部加入到吸附柱（SpinColumnRM）中（吸附柱已裝入收集管CollectionTube中），若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入，12,000rpm離心1分鐘，棄廢液。將吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱的大載量為100µg，不要超載，否則會(huì)影響RNA的產(chǎn)量和純度。
6. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7. 配制DNaseI 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混勻，配制成終體積為80 μl的反應(yīng)液。
8. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
9. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）,12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢
液，將吸附柱放回收集管中。
11. 重復(fù)步驟10。
12. 12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR 等）。
13. 將吸附柱轉(zhuǎn)入新的RNase-Free的1.5ml 收集管中，向吸附膜中間位置加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：1）RNase-FreeWate體積不應(yīng)小于30 μl，體積過小影響回收率。
2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重復(fù)步驟13。
3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟13。
細(xì)胞熒光染料標(biāo)記檢測實(shí)驗(yàn)
RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)代做
